Astrocitos y su papel en el cerebro

Antes conocidos como el "pegamento del cerebro", los astrocitos se están destacando a medida que un amplio conjunto de herramientas revela la complejidad y la diversidad de estas células.

Astrocito: Un astrocito perteneciente a un cachorro de rata
que fue investigado usando una técnica conocida como inmunobarrido.
Imagen: Rachel Kim

A mediados de la década de 1850, el anatomista alemán Rudolf Virchow y colegas que examinaban cerebros bajo el microscopio notaron estructuras misteriosas que llenaban el espacio alrededor y entre las neuronas. Virchow llamó a estas estructuras nervenkitt, literalmente "pegamento nervioso", y se tradujo como "neuroglia".

Hoy en día, los investigadores saben que los nervenkitt son en su mayoría astrocitos, que representan del 20 al 40% de todas las células en un cerebro de mamífero. Sin embargo, durante décadas, los roles de estas células abundantes se mantuvieron tan misteriosos como cuando Virchow vio por primera vez estas estructuras.

A diferencia de las neuronas, los astrocitos son eléctricamente silenciosos, por lo que su actividad no se detecta con los métodos convencionales de electrofisiología. También son asombrosamente complejos: un solo astrocito puede conectarse a decenas de miles de neuronas.

Es por eso que "no ha habido un conjunto de herramientas con las que se pudiera  explorar estas células de manera selectiva y fiable en todo el cerebro", según Baljit Khakh, neurocientífico de la Universidad de California en Los Ángeles (UCLA).

Pero Khakh y un número creciente de investigadores en todo el mundo están comenzando a ir más allá del enfoque centrado en las neuronas para observar de cerca a los astrocitos. Están desarrollando tecnologías para clasificar las células en distintos subtipos con diversos roles y descubrir cómo los astrocitos soportan y dan forma a los circuitos neuronales. Las herramientas podrían incluso ayudar a los investigadores a diseñar métodos para tratar enfermedades cerebrales.

Radios de bicicleta y copos de nieve

Cuando se tiñen con anticuerpos y se observan bajo un microscopio, los astrocitos se asemejan a las ruedas de una bicicleta: un gran cuerpo de células centrales con media docena de radios gruesos, según Shane Liddelow, neurocientífico de la Universidad de Nueva York. Pero cuando las células individuales se inyectan con un tinte fluorescente, se hacen visibles más estructuras. Sus cuerpos centrales  se ramifican en estructuras cada vez más finas, como un copo de nieve en 3D. Estas células en forma de copos de nieve envuelven cada sinapsis en el cerebro, y algunos de los extremos mas finos tienen extensiones en forma de bulbo que rodean los vasos sanguíneos, formando una zona protectora entre el tejido cerebral y la vasculatura.

Calificados como meras células de soporte durante más de un siglo, los astrocitos en realidad tienen funciones cruciales en el cerebro. Los científicos están investigando estas diversas funciones con métodos para clasificar y hacer crecer las células, así como con herramientas de edición genética y técnicas ópticas que rastrean cómo se comportan las células en los circuitos. Estas tecnologías muestran que los astrocitos ajustan sus actividades metabólicas para controlar los niveles de neurotransmisores, regulan los iones de potasio extracelulares para influir en los umbrales de la activación de las células nerviosas y liberan moléculas que promueven la formación y reducción de las sinapsis. Los astrocitos son "el principal homeostato del cerebro", según Khakh.

Para Benjamin Deneen, las primeras pistas de esa diversidad surgieron hace una década, mientras era postdoctorado en el Instituto de Tecnología de California (Caltech) en Pasadena. Él y sus compañeros de trabajo estaban analizando el tejido de la médula espinal de pollos y ratones, y encontraron que los astrocitos exhibían patrones espaciales. Es decir, las combinaciones regionales de proteínas reguladoras de unión al ADN llamadas factores de transcripción determinaban cuándo y qué subtipos de astrocitos se producen.

Eso hizo que Deneen se preguntara acerca de la heterogeneidad en el cerebro. Pero, a diferencia de la médula espinal, donde los patrones están bien definidos, cada área del cerebro parece estar sujeta a diferentes reglas.

Deneen recurrió a una técnica llamada Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS). Utilizando la técnica en ratones que habían sido modificados genéticamente para expresar proteínas fluorescentes verdes específicamente en astrocitos, su equipo fue capaz de subdividir las células en cinco grupos distintos pero superpuestos en base a su expresión de tres proteínas de la superficie celular. Luego, los investigadores utilizaron la secuenciación de ARN para identificar firmas moleculares para cada subpoblación.

En un estudio separado, Khakh y sus colegas aislaron astrocitos de distintos circuitos cerebrales en el nucleo estriado y el hipocampo de ratones de la misma cepa. Utilizaron métodos tales como imágenes de calcio, espectrometría de masas, inmunohistoquímica, microscopía electrónica y secuenciación de ARN para sondear la función celular, morfología y características moleculares.

"Los astrocitos en diferentes partes del cerebro no son lo mismo", según Khakh. Por ejemplo, en el hipocampo, se anidan más cerca de las sinapsis neuronales excitadoras y responden con más fuerza al neurotransmisor glutamato que en las del estriado. "Esto sugiere que los astrocitos pueden ser específicos del área del cerebro, o incluso del circuito neuronal”.

Por su parte, el grupo de Deneen no solo recopiló datos moleculares de subconjuntos de astrocitos aislados con FACS, sino que también analizó la presencia de esas células en modelos de cáncer cerebral en ratones. El equipo identificó poblaciones que se correlacionaban con la progresión del tumor y la aparición de convulsiones. "Estas poblaciones podrían utilizarse como un punto de entrada para comprender las  identidades malignas o diversas de los astrocitos y sus propiedades en la enfermedad”.

Los astrocitos tienen una forma de ramificación 3D distintiva.
 Imagen: Centro Nacional para la Investigación de Microscopía e Imagen, UCSD

Cultivando astrocitos

El método más rápido y fácil de cultivar astrocitos en cultivos celulares se publicó en 1980 y ha sido un puntal de la investigación. "Esencialmente, se  agita el cerebro, se espera un par de semanas, se hace crecer las células en suero, se descartan las células de la parte superior y las que quedan son astrocitos", dice Liddelow. El protocolo es rápido y barato, no requiere equipo especial y produce cientos de millones de células.

Pero hay advertencias sobre este método del "astrocito MD", que lleva el nombre de sus desarrolladores, Ken McCarthy en la Escuela de Medicina de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, y Jean de Vellis en UCLA. Una es que cuando los astrocitos crecen en el suero, pueden comenzar a comportarse de manera muy diferente del estado de reposo fisiológico. Además, dice Liddelow, el método genera un buen número de células precursoras, lo que podría ser problemático dependiendo de lo que los investigadores quieran hacer con los cultivos celulares.

En 2011, surgió un protocolo conocido como immuno-barrido del laboratorio de Ben Barres en la Universidad de Stanford en California. Primero, el procedimiento elimina las células no deseadas a través de una serie de incubaciones en placas recubiertas con anticuerpos contra antígenos que están presentes en las superficies de esas células, y luego se aíslan los astrocitos utilizando anticuerpos que reconocen un marcador de proteína específico, conocido como integrina β-5. "Obtenemos células maduras sin suero en una placa Petri y con menos del 1% de contaminación", según Liddelow, quien utiliza la técnica en su laboratorio.

Esta técnica requiere aproximadamente 6 horas de tiempo práctico, en comparación con 2 a 3 horas para el protocolo MD. Pero las células así obtenidas pueden usarse de inmediato, mientras que el método de DM requiere otras 3 a 4 semanas. Aún así, esta técnica no siempre es la mejor opción. Su rendimiento es aproximadamente un orden de magnitud inferior al del procedimiento MD. También es más caro porque utiliza factores de crecimiento purificados en lugar de suero.

Liddelow y sus colegas han utilizado células obtenidas con la técnica de inmunobarrido para identificar dos subpoblaciones de astrocitos. Los astrocitos A1 pierden su capacidad para promover la formación de sinapsis, mientras que los astrocitos A2 sobreregulan los factores neurotróficos. De acuerdo con esas características, el equipo de Liddelow encontró una gran cantidad de astrocitos A1 en muestras de tejido obtenidos de personas con las enfermedades de Alzheimer, Huntington, Parkinson, Esclerosis lateral amiotrófica o Esclerosis múltiple, lo que sugiere que los astrocitos A1 contribuyen a la muerte celular en trastornos neurodegenerativos.

Para Henrik Ahlenius, un líder de grupo en la Universidad de Lund en Suecia, los astrocitos proporcionan un sustrato para estudiar el Alzheimer, la demencia frontotemporal y otras enfermedades relacionadas con la edad. Pero su investigación requiere astrocitos humanos, que son más grandes y tienen más sinapsis que los astrocitos de ratón. También son más difíciles de obtener.

"Si se desea estudiar la progresión de la enfermedad o los mecanismos en las enfermedades cerebrales crónicas, es muy difícil obtener una muestra del tejido", según  Ahlenius. En los raros casos en que su equipo obtiene células de biopsias o tejido post-mortem, a menudo es difícil trabajar con las muestras porque provienen de la enfermedad en etapa terminal.

En 2015, investigadores en Italia mostraron cómo se podían generar astrocitos de ratón en el laboratorio mediante el cultivo de fibroblastos con tres factores de transcripción, un proceso llamado conversión directa. Ahlenius y sus colegas han probado esas moléculas en células madre embrionarias humanas y encontraron que dos de ellas, NFIB sola o con SOX9, produjeron astrocitos con una pureza de más del 90% en solo una semana.

Estas células se comportan como los astrocitos humanos purificados: pueden captar y liberar glutamato; Responde a los factores de crecimiento y apoya las sinapsis y expresa genes similares. También se pueden usar para modelar la enfermedad de Alexander, un trastorno raro del sistema nervioso.

Un astrocito teñido de tinte obtenido  del hipocampo de rata

 adquiere una apariencia de "copo de nieve". 

Imagen: Centro Nacional para la Investigación de Microscopía e Imagen, UCSD

                              

 

Utilizando la manipulación genética

Para comprender cómo se comportan los astrocitos tanto en la salud como en la enfermedad, los investigadores necesitan herramientas con las que introducir genes de manera fiable y específica. Con ese fin, el laboratorio de Viviana Gradinaru en Caltech ha diseñado vectores basados ​​en virus adenoasociados (AAV) que pueden transmitir genes al cerebro del ratón después de la inyección intravenosa. Estos vectores les permiten a los investigadores aumentar o disminuir el número de células que se etiquetan mientras mantienen una alta expresión.

En última instancia, los científicos quieren estudiar cómo interactúan los astrocitos con las neuronas. A principios de este año, el equipo de Khakh describió un ensayo de proximidad neurona-astrocito que podría determinar a cuál de las decenas de miles de sinapsis cercanas los astrocitos se conectaban realmente.

El ensayo utiliza una técnica llamada transferencia de energía de resonancia de Förster, o FRET, para detectar contactos físicos entre astrocitos y neuronas que expresan proteínas fluorescentes en su superficie. Utilizando este método y los AAV personalizados de su laboratorio, el equipo de Khakh examinó cómo los astrocitos se conectan con la comunicación neuronal en varias enfermedades. En un modelo de ratón de accidente cerebrovascular, los astrocitos marcados con estas proteínas parecían ampliar su alcance, mientras que en los animales que modelan la enfermedad de Huntington, los astrocitos se retractaron de sus procesos e interactuaron con menos sinapsis.

Diseño de circuito

Kira Poskanzer, neurocientífica de la Universidad de California en San Francisco, estudia otro aspecto más de la biología de los astrocitos: cómo responden las células a las señales externas. "Un gran objetivo en nuestro laboratorio es descubrir qué astrocitos están modulando qué neurotransmisores"

Poskanzer colabora con el químico analítico Roberto Etchenique en la Universidad de Buenos Aires para diseñar compuestos "atrapados", en los que los neurotransmisores se unen de manera reversible a grupos químicos que restringen sus interacciones con otras moléculas en la célula. Los compuestos son sensibles a la luz, y liberarán la molécula atrapada cuando se iluminen con luz de una longitud de onda particular.

Hasta el momento, los investigadores han generado formas fotoactivables de los neurotransmisores glutamato, GABA y serotonina, y están desarrollando una forma fotoactivable de noradrenalina. "Estamos tratando de construir un arsenal de herramientas para poder" jugar a dios "con el circuito", según Poskanzer, es decir, activar mediante fotones varios neurotransmisores y ver cómo responden los astrocitos.

Mientras tanto, para investigar qué sucede cuando se silencian los astrocitos, el equipo de Khakh ha desarrollado un método que utiliza una bomba molecular para mover los iones de calcio desde el interior de la célula hacia el exterior y, por lo tanto, amortiguar las señales de calcio de los astrocitos en el cerebro del ratón. Y su equipo está trabajando con Loren Looger en el Campus de Investigación Janelia del Instituto Médico Howard Hughes en Ashburn, Virginia, para desarrollar sensores para ATP y otras moléculas liberadas por los astrocitos.

Estas herramientas deberían ayudar a los investigadores a analizar separadamente la biología de la neuroglia y la de las neuronas que forman el cerebro interconectado. Las tecnologías están proporcionando una apreciación sin precedentes de la riqueza y la dinámica en la forma en que los astrocitos contribuyen a la función del cerebro como órgano.

Basado en: Nature 563, 141-143 (2018) doi: 10.1038/d41586-018-07197-0